反相液相色譜法測(cè)定人血漿中格列吡嗪濃度

 [摘要] 目的 建立反相液相色譜法測(cè)定人血漿中格列吡嗪濃度的方法。
          方法：格列吡嗪血漿樣品在酸性條件下以二氯甲烷-正己烷（50：50）提取，以格列齊特為內(nèi)標(biāo)：色譜柱：Nova-pak C18柱（4.6mm×250mm，4μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.03mol/L。磷酸二氫鉀（pH值=3.0）（59：41）；流速：O.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：228nm。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍20～1000μg/L；回歸方程：Y=0.0034X一0.512，r=0.9992，血漿中格列吡嗪zui低檢測(cè)限為15μg/L。平均提取回收率為（86.8±5.7）％，平均回收率為（104.3±4.3）％，日內(nèi)RSD≤2.9％，日間RSD≤4.9％。結(jié)論：該方法具有良好的準(zhǔn)確性、精密性和較高的靈敏度，適用于格列吡嗪的藥動(dòng)學(xué)研究和治療監(jiān)測(cè)。

【關(guān)鍵詞】格列吡嗪；血藥濃度；反相液相色譜法
         建立人血漿格列吡嗪含量測(cè)定方法，對(duì)服用格列吡嗪的患者進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究，對(duì)于指導(dǎo)患者合理用藥、減少不良反應(yīng)的發(fā)生有一定的臨床意義。筆者建立了安全可靠、準(zhǔn)確、靈敏的測(cè)定人血漿中格列吡嗪的反相液相色譜（RP-HPLC）法，適用于人體內(nèi)格列吡嗪藥動(dòng)學(xué)研究。 

        1 儀器與試劑
         1．1 儀器Waters液相色譜儀：5l5泵；996二極管陣列檢測(cè)器；Rheodyne 7725i進(jìn)樣器；2010Millenium色譜管理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；DZF-3型真空干燥箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）；XW-80A漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。
         1．2 試劑 格列吡嗪對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：960804），格列齊特原料（廣東省藥品檢驗(yàn)所）；空白血漿（廣州市血液中心）；甲醇（色譜純，天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；二氯甲烷、正己烷、磷酸二氫鉀均為分析純。

        2 方法與結(jié)果 
        2．1 色譜條件分析柱：美國(guó)Waters Nova-pak Cl8柱（4.6mmx 250mm，4μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.03mol/L。磷酸二氫鉀（pH值=3.0）（59 ：41）；流速：0.8mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：228nm；進(jìn)樣量：10μL。
         2．2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱(chēng)取格列齊特原料適量置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成300mg/L。的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1.0mL置于50mL容量瓶中，用甲醇配成濃度為6mg/L 的內(nèi)標(biāo)溶液。
        2．3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱(chēng)取格列吡嗪對(duì)照品適量置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成100 mg/L。儲(chǔ)備液。分別精密量取格列吡嗪儲(chǔ)備液1.0mL置于50mL容量瓶中，2.0mL置于25mL容量瓶中，用甲醇配成濃度分別為2.8mg/L的格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液。
        2．4 洋品處理 取1.0mL人血漿樣品，精密加入50μL內(nèi)標(biāo)溶液和100μL鹽酸溶液（2.0mol/L），混合均勻，加入3.0mL二氯甲烷-正己烷（50：50）置于漩渦混合器上混合5min。離心5min（6000r/min）。取有機(jī)相置于另一試管中。水相用同法重復(fù)提取2次，合并有機(jī)相，置于40℃真空干燥箱中干燥。殘?jiān)?0μL甲醇-純化水（59：41）溶解，l0μL進(jìn)樣。
        2．5色譜行為在上述色譜條件下，格列吡嗪、內(nèi)標(biāo)峰形對(duì)稱(chēng)并與內(nèi)源性雜質(zhì)分離良好?格列吡嗪保留時(shí)間為l0.7 min，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為l3.8min。格列吡嗪甲醇溶液、人空白血漿和血漿樣品色譜圖。
        2．6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 于空白血漿中加入不同濃度的格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，使藥物濃度分別為20，50，100，200，500，l000μg/L，按前述方法提取、測(cè)定。以格列吡嗪與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比（以吸收度之比表示）對(duì)格列吡嗪血漿濃度（C）進(jìn)行線性回歸。格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0034C一0.0512，r=0.9992。格列吡嗪血漿樣品在20～1000μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
        2．7 回收率試驗(yàn) 于空白血漿中加入適量格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液，得50，200，500μg/L 3種濃度的質(zhì)控血漿，按前述方法提取、測(cè)定。以1d內(nèi)5次測(cè)得的格列吡嗪濃度計(jì)算方法回收率，并以其峰面積與相應(yīng)濃度未經(jīng)提取的格列吡嗪甲醇溶液直接進(jìn)樣所得峰面積的比值計(jì)算提取回收率。3種質(zhì)控血漿的平均提取回收率為（86.8±5.7）％，平均方法回收率為（104.3±4.3）％，日內(nèi)RSD≤2.9％，日間RSD≤4.9％。
        2．8 精密度試驗(yàn) 按“回收率試驗(yàn)”項(xiàng)下方法配制格列吡嗪質(zhì)控血漿，提取后測(cè)定。以1d內(nèi)5次測(cè)定的格列吡嗪濃度計(jì)算日內(nèi)精密度。另于5d內(nèi)取上述格列吡嗪質(zhì)控血漿每天各測(cè)定1次，計(jì)算13間精密度。
         2．9 zui低檢測(cè) 限于空白血漿中加入適量格列吡嗪工作溶液，制得濃度<20μg/L并逐漸降低的一組樣品。對(duì)每個(gè)濃度的樣品進(jìn)行提取、測(cè)定，以能達(dá)到S／N=3時(shí)樣品的zui低濃度為zui低檢測(cè)限。格列吡嗪zui低檢測(cè)限為l5μg/L。

         3 討論
        目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道大多使用乙醚提取血漿中格列吡嗪 。乙醚雖然容易揮干，但使用前需要重蒸，操作繁瑣且不安全。筆者采用毒性較小的二氯甲烷-正己烷（50：50）作為提取溶劑，操作簡(jiǎn)便、安全可靠，更適于推廣應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)lmL血漿中加入5mL二氯甲烷．正己烷（50：50）提取格列吡嗪容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，血漿樣品與提取溶劑體積比為l：3可避免產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。為了使之提取*，筆者對(duì)血漿樣品進(jìn)行3次提取，結(jié)果顯示本法的提取回收率與固相萃取法（SPE）接近，兩者均>80％。
        本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相pH值為3.0，較文獻(xiàn)報(bào)道為低，使格列吡嗪峰形得到了改善，提高了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。


[參考文獻(xiàn)]
[1] 江志強(qiáng)，張奇志，蔣新國(guó)，等．格列吡嗪2種片劑的藥動(dòng)學(xué)和人體生物利用度比較[J]．中國(guó)新藥與臨床雜志，2000，19（5）：381—384．