反相液相色譜法測定地榆中金絲桃苷的含量

【摘要】目的建立地榆中金絲桃苷的液相色譜含量測定方法。方法采用RP-HPLC測定，C18柱，流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液（46∶54），用三乙胺調pH至3.0，流速1.0 ml·min-1，檢測波長370 nm；供試品溶液的制備采用甲醇超聲提取。結果測定了不同產地不同批次的地榆藥材，金絲桃苷質量分數在0.052%～0.291%。結論該方法靈敏快速，準確可靠，可用于地榆的質量控制。

　　【關鍵詞】  地榆 金絲桃苷 反相液相色譜法

　　Abstract:ObjectiveTo establish a determination method of hyperoside in Sanguisorba officinalis. MethodsRP-HPLC analytical method was established on a Polaris C18column with Methanol-0.2%H3PO4 solution（46:54） as the phase, the flow rate was 1.0 ml·min-1, and the detection wavelength was 370 nm. The method of sample was ultrasonic wave withdraws by Methanol. ResultsThe content of hyperoside was from 0.052～0.291% in different groups of S. officinalis collected from the different locations. ConclusionThe method is  accurate and can be used for the quality of Sanguisorba officinalis.

　　Key words:Sanguisorba officinalis;   Hyperoside ;  RP-HPLC

　　地榆為薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或長葉地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia（Bert.）Yu et Li 的干燥根。其味苦、酸、澀，微寒，具有涼血止血、解毒斂瘡之功效［1，2］?，F代藥理研究表明其具有顯著的鎮痛作用［3］，主要有效成分為黃酮類化合物，但藥典記載質量標準的定量檢測方法僅為紫外-可見分光光度法測定其鞣質含量，該法操作繁瑣。金絲桃苷為地榆藥材中提取得到的黃酮類化合物。研究表明，地榆中的金絲桃苷是其止痛作用的有效成分之一。本實驗采用RP-HPLC法對不同產地中藥材市場商品地榆的金絲桃苷成分進行了定量分析，考察了流通商品地榆的質量狀況，為進一步提高地榆藥材的質量控制提供了科學依據。

　　1  儀器與試藥

　　Agilent 1100液相色譜儀，含在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、智能柱溫箱、紫外可見光檢測器（VWD）、化學工作站。KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

　　地榆藥材于200607中下旬從青海省各地中藥材市場抽取，由青海省藥品檢驗所主任藥師劉海青鑒定為地榆S. officinalis L.的干燥根或飲片。實驗中將樣品粉碎后過100目篩，置干燥器中備用。

　　金絲桃苷（111521-200303，國藥品生物制品檢定所,供含量測定用）。甲醇為色譜純，實驗用水為Milli-Q超純水。其他試劑均為分析純。

　　2  方法與結果

　　2.1  對照品溶液的制備

　　精密稱取金絲桃苷13.25 mg，置量瓶中，加甲醇定容至25 ml，其金絲桃苷含量為0.53 mg·ml-1。再精密吸取金絲桃苷對照品溶液2.0 ml，加甲醇定容至50 ml量瓶中，其金絲桃苷含量為0.021 2 mg·ml-1。

　　2.2  供試品溶液的制備

　　取地榆干燥藥材或飲片的粉末（過100目）1 g，分別精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，超聲提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，用續濾液作為供試品溶液。

　　2.3  色譜條件

　　Hypersil ODS2分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.2%磷酸溶液（46：54），用三乙胺調pH至3.0；流速1.0 ml·min-1；檢測波長370 nm；柱溫25℃；進樣量10 μl；在選定的色譜條件下，色譜柱的分離效率（簡稱柱效）>理論塔板數以金絲桃苷峰計算不低于3 000。分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。色譜圖見圖1。

　　2.4  檢測波長的選擇

　　取金絲桃苷對照品適量，用甲醇溶解后作紫外全波長掃描，λ286，370 nm, 因286 nm下非黃酮物質也有吸收，為避免干擾，選擇檢測波長為370 nm。

　　2.5  線性關系的考察

　　分別精密吸取0.021 2 mg·ml-1的金絲桃苷對照品溶液2，4，6，8，10，12，16 μl注入液相色譜儀，測定基線構成之面積稱峰面積。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h>峰面積，以金絲桃苷含量（X）為橫坐標，其峰面積吸收度積分值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為：Y = 2 263.9X+2.963 5，r = 0.999  8（n =7），表明金絲桃苷在0.04～0.34 μg線性關系良好。
2.6  精密度實驗

　　精密吸取0.021 2 mg·ml-1金絲桃苷對照品溶液10 μl，連續進樣5次，測得峰面積積分值RSD為0.86%，表明精密度良好。

　　2.7  重復性實驗

　　精密稱取同一樣品粉末1 g（5份），按供試品溶液的制備方法制備，進樣10 μl，測得金絲桃苷含量的RSD為0.99%，表明該方法的重復性好。

　　2.8  穩定性實驗同一供試品溶液，從制備完畢開始放置，分別于0，2，4，6，8，10 h進樣檢測，其峰面積積分值RSD為1.9%。表明供試品溶液在10 h內比較穩定。

　　2.9  加樣回收率實驗

　　取已知含量的藥材（6號含量1.60 mg·g-1）樣品6份，每份0.50 g，精密稱定，計算樣品中金絲桃苷量，分別加入適量的金絲桃苷對照品，按樣品制備方法和測試條件進行測定，計算加樣回收率。結果見表1。表1  地榆中金絲桃苷的加樣回收率（略）

　　2.10   樣品測定

　　分別精密吸取各樣品10 μl進樣測定，計算含量，結果見表2。 表2  不同產地地榆樣品的金絲桃苷含量（略）

　　3  討論

　　3.1  提取條件的選擇

　　根據金絲桃苷的溶解性能，選擇乙醇、甲醇、醋酸乙酯作為提取溶劑，比較了3種提取溶劑提取方法（超聲、回流及索氏提取）和不同提取時間（0.5，1.0，1.5 h）對提取效果的影響。結果顯示采用超聲提取方法的提取率zui高，甲醇提取效果，含量結果表明超聲提取1.0 h可使待測成分提取*。實驗證實，含量并未隨著提取時間延長而有所增加，超過1 h時含量甚至有下降的趨勢。

　　3.2   流動相的選擇

　　由于金絲桃苷為黃酮類化合物，本實驗采用甲醇和0.2%磷酸溶液的二元流動相體系，但實驗中發現拖尾峰（tailing peak）。前者少見。>色譜峰有拖尾現象。經反復實驗發現，在1 000 ml的0.2%磷酸溶液中加入1.8 ml三乙胺時的分離效果*，經多次，多批樣品測試，系統具有良好的重復性和穩定性，三乙胺能與ODS柱中鍵合相的殘余硅醇基相互作用，提高分離度，有助于改善峰形。因此以甲醇-0.2%磷酸溶液（46∶54）用三乙胺調pH至3.0為優，分離效果較好，保留時間適中，且無干擾［3］。本方法操作簡便、快速、重復性好，適用于地榆中金絲桃苷含量的測定。

　　3.3  樣品分析

　　本文對不同產地地榆中的金絲桃苷含量進行了測定，結果表明，不同產地金絲桃苷的含量存在著一定的差異，有必要對其進行質量控制。

　　《中國藥典》中地榆質量標準的定量檢測方法操作較為繁瑣，根據本實驗的測定結果，RP-HPLC可以較好地對金絲桃苷進行有效分離，方法簡便、準確、靈敏，可作為地榆質量控制的指標成分。

　　【參考文獻】
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